高效液相色谱法同时测定发酵液中胡椒醛、胡椒酸以及黄樟油素

赵明涛，郑璞，邢晨光，刘思琴，赵希景，陈鹏程

江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室；厦门欧米克生物科技有限公司生物工程试验室

胡椒醛(Piperonal)，又称洋茉莉醛(Heliotropine)，化学名称为3，4-亚甲二氧基苯甲醛。19世纪中叶，FITTING和MIELCH在研究胡椒碱的水解以及氧化过程中发现了胡椒醛[1]。胡椒醛在香英豆、刺槐花等植物中少量存在，被广泛应用于食用香精、皂用、化妆品、医药以及电镀等工业，是世界上最主要的香料之一[2]。目前，胡椒醛的工业生产主要由化学合成，但是化学合成过程中存在环境污染、产率低、操作难度大等缺陷。近年来，生物技术合成胡椒醛的研究逐渐兴起[3]。一些微生物能够通过微生物发酵或添加前体转化产生芳香醛、芳香酸等物质。因此，准确测定发酵过程中底物的消耗，产物胡椒醛及其胡椒酸的生成，对于研究利用微生物生产胡椒醛具有重要意义。

目前定量测定发酵液中的芳香醛类主要采用高效液相色谱法(highperformanceliquidchromatography，HPLC)[4-6]，气相色谱法(gasphasechromatography，GC)[7-8]。RYU[9-10]等利用高效液相色谱法，采用梯度洗脱程序,对微生物发酵液中的丁香酚、异丁香酚、香兰素以及阿魏酸等苯丙素类化合物进行了定量测定。但在胡椒醛的微生物法制备中，一般采用GC方法测定发酵液中的产物含量。如SANTOS[7-8]等以氢气为载气检测真菌、酵母和细菌发酵液中的胡椒醛。其中Aspergillus、Cladosporium,Peacilomyces和Pseudomonas三株菌株的发酵液最高含64mg/L胡椒醛。本课题组前期筛选到1株能够发酵产胡椒醛的液化沙雷氏菌CCTCCNo：M，本文通过建立梯度洗脱高效液相色谱法，实现了同时检测发酵液中的胡椒醛、胡椒酸以及黄樟油素，为进一步选育高产菌株和优化发酵工艺奠定了基础。

1.1仪器与试剂

HITACHIChromaster高效液相色谱仪，HITACHIChromasterDVD检测器，HITACHIChromaster泵结构，HITACHIChromaster柱温箱，HITACHIChromaster自动进样器；美国赛分科技有限公司AmethystC18-H反向柱(4.6mm×mm，5μm)。

乙腈为色谱纯，乙酸乙酯和甲酸均为分析纯，实验用水为超纯水。

标准品：胡椒醛和黄樟油素，由厦门嘉盟生物科技有限公司；胡椒酸，北京百灵威科技有限公司。

1.2菌种

液化沙雷氏菌(SerratialiquefaciensCCTCCNo：M)保藏于中国典型培养物保藏中心，从黑龙江原始森林土壤中筛选获得。

1.3菌株培养以及发酵条件

种子培养基：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，葡萄糖10g，蒸馏水1L，pH自然。

发酵培养基：NH4NO31g，MgSO4·7H2O0.5g，KH2PO40.5g，K2HPO41.5g，NaCl0.5g，酵母膏0.5g，葡萄糖5g，蒸馏水1L，pH7.0。

发酵条件：将斜面保藏的液化沙雷氏菌接种于装有30mL种子培养基的mL锥形瓶中，在30℃下培养15～20h。然后种子液接种于发酵培养基中，30℃下培养20h，然后向发酵液中加入底物至终质量浓度1g/L，继续发酵48h。

1.4样品的处理

取5mL发酵液，用2倍体积的乙酸乙酯进行萃取，萃取液利用0.45μm的有机滤膜过滤，过滤液进样检测。

1.5实验方法

1.5.1标准溶液的配制

准确称取一定量的胡椒醛、胡椒酸以及黄樟油素，用乙酸乙酯配制成质量浓度均为1g/L的混合标样。

1.5.2HPLC检测条件

色谱柱：AmethystC18-H反向柱(4.6mm×mm，5μm)；UV检测器；流动相A：乙腈，流动相B：0.1%甲酸水溶液；柱温30～40℃；流速1.0mL/min；检测波长nm；进样量10μL；梯度洗脱程序见表1。

2.1胡椒醛、胡椒酸和黄樟油素分离条件的选择

2.1.1检测波长的选择

采用RYU[9-10]等报道的nm。

2.1.2流动相的选择

根据RYU[9-10]等的报道，对于苯丙素类化合物可以采用乙腈与水作为流动相测定，流动相中添加适量甲酸可以调节pH以抑制其相应酸的解离，改善色谱峰型、提高分离度[11-12]。本文先分别选用2种不同比例的流动相[V(乙腈)∶V(水)∶V(甲酸)=55∶45∶0.1和V(乙腈)∶V(水)∶V(甲酸)=70∶30∶0.1]，比较采用等度洗脱方法分离胡椒醛、胡椒酸以及黄樟油素的情况(图1)。样品用乙酸乙酯溶解。从图1A中可以看出，胡椒醛与胡椒酸不能分离，黄樟油素与乙酸乙酯的出峰存在叠加(18min处)，并且黄樟油素出现不良峰型。改变流动相配比，如图1B所示，胡椒醛、胡椒酸以及黄樟油素的出峰时间均提前，但仍不能达到分离的效果。

1-胡椒醛和胡椒酸；2-黄樟油素图1混合标样等度洗脱色谱图Fig.1Chromatogramsofmixedstandardsampleusingisocraticelution

改用梯度洗脱程序(表1)，其中流动相为A为乙腈，流动相B为0.1%甲酸水溶液。随着乙腈体积分数的增加，待测物质根据极性强弱顺序出峰，能很好地实现基线分离，分离度好(R1.5)，并且峰型良好(图2)。

表1梯队洗脱程序

Table1Gradientelutionprogram

1-胡椒酸;2-胡椒醛;3-黄樟油素图2混合标样梯度洗脱色谱图Fig.2Chromatogramsofmixedstandardsampleusinggradientelution

2.1.3柱温

分别选取柱温30、35和40℃。实验结果表明(图3)，柱温对待测物质的分离影响较小，虽然随着柱温的上升，待测物质保留时间在提前，但幅度较小，并没有出现峰叠加、峰型过宽等问题。

■-胡椒酸；●-胡椒醛；▲-黄樟油素图3柱温对胡椒醛、胡椒酸以及黄樟油素保留时间的影响Fig.3Effectofcolumntemperatureontheretentiontimeofpiperonal,piperonylicacidandsafrole

2.2外标工作曲线和线性范围的确定

将混合标准液在上述得到的色谱条件下进行定量分析，以峰面积外标法定量，得出胡椒醛、胡椒酸以及黄樟油素的标准曲线方程及相关系数(见表2)。其中，3种物质在10～mg/L的质量浓度范围内，线性关系良好。

表2回归方程、线性范围和检测限(n=5)

Table2Regressionequation,linearrangeanddetectionlimit(n=5)

注：y：峰面积(mAu*s)；X：质量浓度(g/L)。

2.3溶液稳定性实验

取按1.5.1方法制备的混合样品，稀释至终质量浓度为mg/L，分别在室温放置0，3，6，12，24h后进行考察。供试品室温放置24h后，胡椒醛、胡椒酸以及黄樟油素的平均RSD分别为0.65%，0.98%，0.77%。表明溶液在制备24h基本稳定。

2.4重现性实验

取按1.5.1方法制备的混合样品，平行制备5份供试品溶液，样品溶度为mg/L。按照上述色谱条件测定，计算含量。结果表明，胡椒醛、胡椒酸以及黄樟油素的平均含量为.95，.51，.12mg/L，平均RSD分别为0.56%，0.68%，0.62%。表明方法重现性良好。

2.5发酵液中胡椒醛、胡椒酸以及异黄樟素的分离检测

按照1.3的方法进行整个发酵过程的操作，取发酵48h的发酵液5mL，按1.4的方法进行样品处理，测定胡椒醛、胡椒酸以及异黄樟素的含量，分析谱图见图4。在S.liquefaciensM发酵液样品中，检测到9.8mg/L胡椒酸，mg/L胡椒醛以及黄樟油素mg/L。

1-胡椒酸;2-胡椒醛;3-黄樟油素图4发酵液分析谱图Fig.4HPLCchromatogramsoffermentationbroth

2.6回收率与精密度实验

在已知含量的发酵样品中添加一定量的胡椒醛、胡椒酸以及黄樟油素标准品，在上述色谱条件下进行测定，并计算此3种物质的加标回收率，结果见表3。

表3胡椒醛、胡椒酸以及黄樟油素回收率与精密度测定结果(n=3)

Table3Resultsofrecoverytestandprecisionofpiperonal,piperonylicacidandsafrole

本文建立了高效液相色谱法同时检测S.liquefaciensM菌株发酵过程发酵液中的胡椒酸、胡椒醛以及黄樟油素的分析方法，通过分析流动相成分及其配比、柱温以及离子抑制剂实验得出，采用乙腈与0.1%甲酸水溶液作为流动相，按照表1所述的梯度洗脱程序，控制柱温30℃的色谱条件，对发酵液中的胡椒酸、胡椒醛以及黄樟油素3种物质进行了有效的分离以及定量检测。该方法具有分离效果好、定性及定量准确、分析时间较短等优点，可以用于生物技术制备胡椒醛。

参考文献

[1]曹秀格，倪棠棣，张保格，等.胡椒醛的合成及发展方向[J].湖北化工，9(3)：14-15.

[2]黄彪.胡椒醛研究综述[J].福建林学院学报，2,12(2)：-.

[3]HANDF,RYUJY,LEEH,HURHG.Bacterialbiotransformationofphenylpropanoid







































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